2003年,还在杭州艺校上学的叶祖新被选中参与演出《情断上海滩》而进入演艺圈。
2005年,叶祖新参演古装电视剧《李小环与苗翠花》,扮演方世玉;同一年,参演古装宫斗电视剧《大清后宫》,扮演少年道光帝。订葛轿2006年参演家庭伦理电视剧《死去活来》,扮演樊涛;参演古装历史电视剧《皇上二大爷》,扮演赵金山。
2008年,叶祖新参演战争历史电视剧《父亲的战争》,扮演彭龙。
2009年,叶祖新参演古装历史电视剧《杨贵妃秘史》,扮演韦坚;同一年参演家族斗争电视剧《大管家》,扮演李复修;参演战争历史电视剧《内线》,扮演苏子童。2010年,参演古装历史电视剧《大唐女巡按》,扮演欧阳;参演古装神话电视剧《活佛济公2》,分饰必清、瘦仙童两角;参演寻亲电视剧《杜鹃的女儿》,扮演小吴。
2011年,叶祖新参演穿越电视剧《步步惊心》,扮演十阿哥乃凳煮墓胤誐;参演古装搞笑电视剧《怪侠欧阳德》,扮演淳贝勒。
2012年,叶祖新参演爱情励志电视剧《错点鸳鸯》,扮演冷刚;参演传奇抗战题材电视剧《五台山抗日传奇之女尼排》,扮演任松良;参演古装历史电视剧《薛平贵与王宝钏》,扮演叶公公;参演战争历史电视剧《向着胜利前进》,扮演何医生;参演古装武侠电视剧《新白发魔女传》,扮演辛龙子;在古装历史传奇电视剧《隋唐英雄》中扮演裴元庆。
2014年,叶祖新参演古装神话电视剧《欢天喜地俏冤家》,扮演高富帅;参演都市爱情电视剧《步步惊情》,扮演JACK;参演古装搞笑爱情电视剧《犀利仁师》,扮演范大同;参演都市爱情电视剧《说好的幸福》,扮演许诺;参演古装历史局兰辣店传奇电视剧《隋唐英雄4》,扮演薛丁山。
2015年1月份,叶祖新参演《蜀山战纪之剑侠传奇》,扮演医术不凡的张馅饼;8月参演的抗日电视剧《铁在烧》在浙江、安徽卫视播出,扮演走上歧路悲剧收场的丁丑娃;9月主演的爱情喜剧电影《穷途》上映,扮演前往苗寨寻找药方的男主角邹孝宇;参演都市情感电视剧《爱情万万岁》,扮演为爱痴狂的90后新新人类金波;11月参演庄园爱情电视剧《我们的秘密》,扮演为情所苦的造型师罗仁;11月与黄世超、杨世瀚、张思帆共同演唱的电视剧《蜀山战纪》片尾曲《我就是我》单曲发布。12月主演民国动作悬疑电视剧《左眼诡事》,扮演左眼能看到鬼魂的男主角尹明涯。
2016年,叶祖新8月参演都市剧《一粒红尘》,扮演痴情的酒吧老板闵朗。12月份,主演的青春励志偶像剧巩格询《食全食美》开机,扮演男主角打假卫士吴佑。
2017年3月31日,叶祖新参演的悬疑电影《嫌疑人X的献身》在中国大陆上映,扮演破案的线索人物罗淼警官。
2018年9月17日,叶祖新参演的泪敬现代剧《橙红年代》播出,扮演正义青年贝小帅。
2019年8月份,叶祖新参演电视剧《我们的西南联大》。
2020年1月5日,叶祖新和韩庚、王晓晨等人合作主演的都市情感剧《还没爱够》在江苏卫视播出;同一年4月份,参演的古代传奇剧《清平乐》播出,他在剧中扮演内侍总管张茂则。
叶祖新人物评价
叶祖新,时而搞怪卖萌,时而循拘定深情凝望,诙谐的动作与明朗的笑容相得益彰,尽展其帅气的多面性。(中国日报网评价)叶祖新在《隋唐英雄》中所诠释的薛丁山,别与以往的角色,帅气的英姿驾驭于骏马之上,饱含深情的双眸让人感慨。(新民网评价)叶祖新凭靠自身细腻的演技将《铁在烧》中的丁丑娃诠释的有血有肉,爱恨鲜活。(网易娱评)戏外的他孝顺父母又很体贴照顾别人,被赞是暖男。(新华网、搜狐娱评)